脂肪干細胞在皮下軟組織充填中的研究進展

http://www.apsc.com.hk/chi/placenta-hk.htm

皮下軟組織充填一直是整形外科常見的治療手段，對于體表的皮下軟組織欠豐滿、凹陷、萎縮畸形目前常采用自體游離脂肪或各種人工材料進行充填。人工材料因存在排異、創傷大及安全性等問題難以滿足臨床需要，而自體游離脂肪的移植成活率僅為40%～50%，這使得其臨床應用受到很大限制。脂肪移植物被吸收的原因之一是成熟脂肪細胞對缺氧、損傷的耐受力低，且不能增殖更新。而脂肪干細胞（ADSCs）則具有強大的增殖分化潛力，對缺氧耐受力更強，且自體干細胞用于移植可避免排異反應，更加安全。2001年Zuk等從脂肪細胞抽吸物中成功分離培養出具有骨、軟骨、脂肪、肌肉等多向分化潛能的細胞，cronthos等于同年也證實脂肪來源細胞中的確存在具有間充質干細胞特性的細胞。2002年Zuk等又證實了人的脂肪組織是多能干細胞的一個來源，具有分化為所有中胚層起源細胞的能力，還可分化為部分內外胚層起源的細胞，自此脂肪干細胞(ADSCs)以其來源豐富、易于獲得、能在體外多代穩定增殖、具有多向分化潛能、免疫相容性好、取材對患者損傷小等優點而日益成為研究熱點。現將其成脂誘導及誘導后復合生物支架材料用于軟組織填充修復研究現狀綜述如下。 1取材、提取、體外擴增 取材部位最好能配合患者身體塑形的需要，做到一舉兩得。平均每300ml脂肪組織可獲得2×lO8～6×l08個干細胞，從不同個體的脂肪抽吸組織中提取的平均脂肪干細胞數目有所不同，但從同一個體不同部位的脂肪中所獲得的干細胞數目卻比較近似。患者年齡越大，成脂分化率越低，同一患者不同部位來源的脂肪抽吸組織中的脂肪干細胞在成脂誘導分化能力上存在差異。 目前常采用電動負壓吸脂術或注射器手工抽脂術獲取無菌脂肪組織，一般認為注射器手工抽取的脂肪損傷較小。利用分層純化法將脂肪混合物靜置片刻，分別去除上下兩層。將獲得的脂肪去除紅細胞和細胞碎片，消化所得細胞除用于延續培養和進行相關實驗外，其余可按照一般方法凍存。凍存后6個月內，以37℃水浴快速復蘇細胞，接種于培養皿中可繼續傳代擴增。 脂肪干細胞至少能保持20代的傳代活性，且細胞倍增時間與年齡呈正相關，即年輕人較年老者的脂肪干細胞具有更強的增殖能力。自分泌成纖維細胞生長因子2（FGF-2）對于人體脂肪干細胞的自我增殖具有關鍵性意義。脂肪干細胞在體外的倍增時間按照培養基的類型和傳代數目的不同大致為2～4天，且在傳代中保持其端粒酶的長度。但也有報道稱端粒酶在遞進式傳代過程中會逐漸失去活性并縮短。此類研究涉及ASCs移植的安全性問題，有報道稱觀測到人類ASCs在經歷長期傳代（>4個月）后發生惡變。提示對于ASCs移植必須建立一套嚴格的安全性檢測體系，其中應包含染色體組型測定。 2 ASCs生物學特性 從肉眼上脂肪組織可被區分為，骨髓內脂肪、棕色脂肪、乳房脂肪、機械充填脂肪、白色脂肪等至少5種類型。每種脂肪各自具有不同的生物學特性及功能。因各類脂肪皆有內分泌功能可分泌瘦素、抵抗素等激素參與全身生理調節，脂肪組織做為整體目前傾向于被認為是一個內分泌器官。從人脂肪組織中提取的ASCs，以DMEM培養，流式細胞儀檢測表面抗原，以集落形成能力和群體倍增時間來評估增殖潛力，油紅0染色來觀察ASCs經成脂誘導后中性脂類的蓄積，發現ASCs表達CD44、CD73、CD90、CD105，不表達CD14、CD31、CD45，具有很高的增殖潛力和多向分化潛能，且良好的免疫相容性類似于BMSCs。中性脂肪干細胞形態以梭形為主，CD11b、CD45、CD49d、CD80、CD86表達陰性，MHC I、MHC lI表達弱陽性，CD29、CD44、CD54的表達陽性。第l1代以前的脂肪干細胞有較強的活力和增殖能力，體外培養至第10代，其細胞仍穩定為二倍體核型BrdU可標記其核。說明ASCs具有較強的自我更新能力，其形態和表面標志均類似于BMSCs。基于流式細胞儀分析和逆轉錄多聚酶鏈反應研究，發現hADAS細胞不表達一些其它干細胞群表達的蛋白質，包括端粒末端轉移酶、CD133、膜轉運ABCG2[15]。另有研究對三種來源（骨髓、臍血、脂肪組織）的干細胞在分離成功率、增殖能力、分化潛力、免疫表型等方面進行比較，發現三種來源的干細胞在組織形態和免疫表型上無顯著差異，而在其他生物學特性方面差異明顯，如脂肪來源的干細胞增殖能力明顯強于另外兩者，臍血來源干細胞增殖能力最弱且不具備向脂肪組織分化能力。相關研究還表明ASCs較BMSCs具有更好的遺傳穩定性。 3體外誘導分化 ASCs具有多向分化潛能，不僅能分化為中胚層細胞，如脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞，還能分化為外胚層及內胚層細胞，如神經細胞、肝細胞等。目前尚無標準誘導方案，也都未能得到成熟細胞。一般而言，利用脂肪干細胞充填皮下軟組織，實驗設計皆為在體外用以上培養基誘導至一定階段后再復合支架材料植入體內，細胞移植成功率為50%～80%不等。因其移植成活率較低且不穩定，尚未達到臨床應用要求水平，有學者設想可在體外模擬體內微環境誘導干細胞進一步分化成熟從而提高移植存活率。也有意見認為分離得到的干細胞無需體外誘導，直接復合支架植入體內，體內的微環境即可自行確定分化方向并可能以此提高移植細胞存活率，以上觀點均需進一步的實驗驗證。 4載體支架材料 組織工程技術主要包括生物材料載體、種子細胞及訊息因子。理想的生物載體材料應具有良好的生物相容性，對細胞和組織等無毒性，能以適當速度被吸收降解，強度適中，利于細胞生長和周圍組織長入。因不同材料對細胞的生長分化和黏附均有不同的影響，不同的細胞對支架的要求也不盡相同，因而種子細胞能否在支架材料上良好生長并表達自身特異性功能取決于二者的適配程度。 理論上講，可用于復合脂肪干細胞的生物支架按材料分為三大類：①天然生物材料，如膠原、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素等，此類材料以仿生原理模擬細胞外基質組成；②合成生物材料，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚（乳酸－乙醇酸）共聚體等，此類材料具有的優勢為可控的降解性；③復合生物材料，為兩種或多種天然生物材料或（與）合成生物材料復合而成，具有仿生及可控性的多元優勢。按支架的構建方式可分為：三維多孔支架，如PLA多孔支架、膠原/殼聚糖多孔支架，可廣泛應用于多種細胞及干細胞的復合移植；凝膠填充支架，如水凝膠填充支架，可用于軟骨等的修復；薄膜支架，多用于血管的修復重建；微粒支架，如PLLA微粒支架等。對于支架的生物相容性研究，也經歷了生物惰性材料、可調控細胞行為功能的生物活性可吸收材料、具有激活機體再生潛能的組織誘導型生物材料等發展階段。 目前脂肪干細胞復合支架移植仍處于動物實驗階段，移植后細胞生長變化過程及相關影響因素尚不十分清楚，所用材料主要以天然生物材料為主，與新型組織誘導型材料復合的研究較少，移植存活率不同實驗結果相差很大，其最適材 料仍有待于進一步研究與選擇。 5需解決的問題 關于脂肪干細胞的應用，目前仍有許多重要問題有待探索、解決。首先脂肪干細胞在無免疫力的移植受體上表現出的腫瘤樣無限增生特性，在進入臨床實驗前仍需尋找并建立合適的動物模型進行長期觀測以確定其移植后安全性。其次，在批量提取生產脂肪干細胞的過程中，如何保障細胞質量的均一穩定仍然有待進一步研究。 綜上所述，ASCs具有來源豐富、易于獲得、具有多向分化潛能、免疫相容性好、可反復取材、對患者損傷小等優點，相較BMSCs具有更加強大的體外多代增殖能力，相較胚胎干細胞而言可避開倫理學問題。取材時可結合美容塑形的要求取得一舉兩得的效果。因此是可利用的種子細胞，有望在一定條件下，定向誘導分化為脂肪細胞，提高自體脂肪移植存活率，達到臨床治療目的。 TAG: 臍帶血| 臍帶| 臍帶幹細胞| 脂肪幹細胞| 胎盤幹細胞| 羊胎水| 抗衰老|